線維芽細胞を、0.5 mlの線維芽細胞増殖培地（FGM）中の24ウェルプレートの個々のウェルに播種し、37±2℃および5±1％CO2で一晩インキュベートした。翌日、培地を吸引により除去して非付着細胞を除去し、0.5 mlの新鮮なFGMと置き換えた。細胞は、48～72時間ごとに培地を交換しながら、コンフルエントになるまで増殖させた。コンフルエントに達したら、細胞を 1.5% FBS を添加した DMEM で 24 時間処理して、通常の培地に含まれる成長因子の影響を洗い流しました。この 24 時間のウォッシュアウト期間の後、細胞を、1.5% FBS を含む FGM に溶解した指定濃度の試験物質で処理しました。 TGF-B (50 ng/ml) をコラーゲンおよびエラスチンのポジティブコントロールとして使用し、100 uM DbcAMP をヒアルロン酸のポジティブコントロールとして使用しました。未処理の細胞（陰性対照）には、1.5% FBSを含むDMEMを与えたばかりです。細胞を48時間インキュベートし、インキュベーション期間の終わりに細胞培養培地を収集し、凍結保存(-75℃)するか、直ちにアッセイしました。材料は三重にテストされました。

2日間のインキュベーション後、細胞培養培地を除去し(上記参照)、線維芽細胞をPBSで2回洗浄して、残っている試験物質を除去した。最終洗浄後、0.5 mg/ml MTTを補充したDMEM 500 μlを各ウェルに添加し、細胞を37±2℃および5±1% CO2で1時間インキュベートした。インキュベーション後、DMEM/MTT溶液を除去し、細胞をPBSで再度1回洗浄した後、0.5mlのイソプロピルアルコールをウェルに加えて紫色のホルマジン結晶を抽出した。 200マイクロリットルのイソプロピル抽出物を96ウェルプレートに移し、イソプロピルアルコールをブランクとして使用してプレートを540nmで読み取った。ネガティブコントロール細胞の平均 MTT 吸光度値を計算し、100% の細胞生存率を表すために使用しました。次に、さまざまな処理を受けた細胞の個々の MTT 値をネガティブ コントロール細胞の平均値で割ってパーセントとして表し、各処理によって引き起こされた細胞生存率の変化を決定しました。

一連のヒアルロン酸標準を 50 ng/ml から 3,200 ng/ml の範囲で調製しました。次に、100 μl の各標準およびサンプルをインキュベーション プレートのウェルに移しました。 50μlの検出溶液を各ウェル(試薬ブランクウェルを除く)に添加した後、プレートを37±2℃で1±0.25時間インキュベートした。インキュベーション後、インキュベーションプレートからの各サンプル/標準の100μlをELISAプレートの対応するウェルに移した。 ELISAプレートを覆い、4℃で30±5分間インキュベートし、次いで300μlの洗浄緩衝液で3回洗浄した。最終洗浄後、100μlの酵素溶液を各ウェルに添加し、プレートを37±2℃で30±5分間インキュベートした。このインキュベーション後、ウェルを上記のように再度洗浄し、次いで酵素基質溶液100μlを各ウェルに添加し、プレートを室温で30～45分間インキュベートした。この最後のインキュベーションの後、50μlの停止溶液を各ウェルに添加し、プレートリーダーを使用してプレートの吸光度を405nmで測定した。